Establishment of a cell micropatterning method for the quantitative assessment of the organization of the keratin filament network

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Cell micropatterning – a powerful tool to control cell shape.

Im folgenden findet ihr hier meine Masterarbeit. Die Arbeiten dazu habe ich am Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie der Uniklinik RWTH Aachen unter Aufsicht von Rudolf Leube und Reinhard Windoffer durchgeführt. Ich stelle meine Arbeit hier hoch, in der Überzeugung, dass das an der Universität erlangte Wissen ein Gemeingut darstellt, welches der breiten Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt werden muss. Forschung, wie sie an Universitäten durchgeführt wird, ist nur mit Hilfe öffentlicher Zuwendungen z.B. durch entsprechende Förderprogramme der Regierung möglich, welche steuerlich finanziert werden. Aus diesem Grund hat die Öffentlichkeit ein Recht auf den freien Zugang zu dem erlangten Wissen und dieses Wissen sollte ihm nicht durch das Closed Access Monopol akademischer Verlage vorenthalten werden können! Wissen, das mit Hilfe gesellschaftlicher Mittel gewonnen wurde, sollte nicht privatisiert werden dürfen, was heute in vielen Fällen faktisch der Fall ist. Durch das Hochladen dieser Arbeit möchte ich meinen Dank an all die Menschen zum Ausdruck bringen, welche mir diese wundervolle Chance ermöglicht haben, an der Forschung beteiligt zu sein. Danke!

I Abstract
Cells are highly sensitive to physical and mechanical cues arising within the microenvironment, which have important effects on cellular processes and subsequent biological responses. The cytoskeleton plays a pivotal role in sensing biomechanical cues and translating it into biochemical signals but it is also of vital importance as a stress-bearing structure for maintaining cell integrity and stability by reorganizing single cytoskeletal elements upon mechanical stimulation. The keratin intermediate filament network contributes to the mechanical resilience of epithelial cells by undergoing a continuous cycle of remodeling in response to mechanical forces. Alterations of the keratin dynamics are difficult to quantify in cells grown under classical culture conditions since the cell shape is transitory due to uncontrollable cell polarity, migration and division. Adhesive micropatterns enable control over cell shape and function. This work explores the possibility to manipulate cell shape and size through cell micropatterning techniques in order to enable an easier quantification of the keratin filament distribution.

In the course of the experiments, stencil patterning was established as the preferred method of choice due to its superior performance in fabricating accurately shaped micropatterns with a uniform and homogeneous protein coating. Micropatterns with different sizes and shapes were designed and the optimal sizes and shapes for a high yield of single cells of selected cell lines was ascertained. The results obtained from normalized cells indicate that the keratin intermediate filament network does not respond to local geometrical cues because differently shaped cells revealed similarities in the average distribution of the keratin intermediate filaments. Nonetheless, the results demonstrate the utility of cell micropatterning for quantitatively assessing the contribution of the cytoskeleton to cellular behavior. The establishment of stencil patterning and the subsequent results of this work motivate further extensive investigations of the keratin intermediate filament network, as well as its interplay with other cellular components.
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Cell micropatterning und die schönen Künste

Cell Micropatterning
Retinae Pigmentepithelzellen (RPE1) kultiviert auf Anker-förmige Mikrostrukturen. Gefärbt ist das Aktin-Zytoskelett (grün) und das Protein Transferrin (rot). Aus Grossier et al. (2014) veröffentlicht in The EMBO Journal; approved permission request by John Wiley and Sons.

Wenn unter Künsten die schönen Künste verstanden werden, ist für mich Cell micropatterning die Ikone der Kunst in der Zellbiologie schlechthin.

Was versteht man unter Cell micropatterning?

Cell micropatterning steht für eine Vielzahl von verschiedenen Methoden, welche die genaue Kontrolle über die Zellform und Zellpositionierung auf einem Substrat gemeinsam haben. Zum Beispiel ist es möglich, einzelne Zellen in Form eines Kreises, Vierecks, Dreiecks oder gar eins Sterns oder Mondes zu kultivieren.

Um zu verstehen, wie Zellen eine solche Form annehmen können, muss man wissen, dass Zellen in ihrer natürlichen Umgebung, d.h. in vivo von einem komplexen Netzwerk von sezernierten Proteinen und Kohlenhydraten umgeben sind, bestehend z.B. aus Fibronektin, Collagen oder Laminin, zusammengefasst unter dem Begriff extrazelluläre Matrix (EZM). Die extrazelluläre Matrix dient einfach ausgedrückt als Fixierungsmöglichkeit für Zellen. Ferner reguliert die EZM-Zell-Interaktion das Verhalten der Zelle während des Zellwachstums, der Proliferation, der Differenzierung oder der Zellmigration.

Wenn nun die extrazelluläre Matrix als eine Fixierungsmöglichkeit, also als ein Adhäsionsvermittler (banal formuliert als eine Art „Kleber“) dient, bedeutet das, dass sich Zellen auf diesen adhäsiven Regionen ansiedeln können. Mehr lesen

First things first

Es war etwa um diese Zeit vergangenen Jahres, dass ich mit meiner externen Masterarbeit am Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie am UK Aachen der RWTH begonnen habe. Die Arbeit ist jetzt endlich abgegeben und in wenigen Tagen findet mein Abschlussvortrag in Marburg statt, danach bin ich eine freie Frau. Naja, d.h. fast, denn offiziell werde ich Anfang nächsten Jahres meine Stelle als Doktorandin an selbigem Institut in Aachen antreten!

Es hat viel Spaß gemacht, am dem Thema der Masterarbeit zu sitzen und daran zu arbeiten. Im Vergleich zu den gängigen molekularbiologischen-biochemischen Methoden in der Biologie habe ich mich in der Masterarbeit mit einer relativ neuen Methode beschäftigt, die sich cell micropatterning nennt. Im Prinzip geht es darum, Zellen, welche unter klassischen Zellkultur-Bedingungen i.d.R. keine spezifische Zellform aufweisen, mit Hilfe spezieller Methoden dazu zu animieren, ihr Wachstum und ihre Morphologie vordefinierten geometrischen Formen anzupassen. Als sich mir die Aufgabe stellte, diese Methode in der Arbeitsgruppe in Aachen zu etablieren, erwartete ich nicht, wie sehr mir cell micropatterning trotz aller Anstrengungen und Hindernisse Spaß bereiten würde. Das Thema entpuppte sich wie geschaffen für mich, ich, die ja so sehr auf Layout und Gestaltung achte und gerne organisiere. Da bietet sich cell micropatterning in der Biologie als das ultimative Werkzeug für effizientes Organisieren und Gestalten an! Gut, dass ich cell micropatterning auch nach meiner Masterarbeit weiterhin verwenden darf, denn ich bin mir nicht mehr sicher, ob die Biologie und v.a. das Arbeiten mit Primär- bzw. Sekundärzellen ohne cell micropatterning noch einen besonderen Reiz auf mich ausüben würde.

Nächste Woche ist mein Abschlussvortrag, ach ja, das habe ich ja schon bereits erwähnt… Ich hoffe, ich kann meine Begeisterung und die Arbeit, die ich in das Thema investiert habe, während des Vortrags gut zum Ausdruck bringen. Ich stelle es mir nicht leicht vor, eine externe Arbeit, welche ich mir in einem anderen Institut, an einer anderen Universität und in einer anderen Stadt erarbeitet habe, der eigentlichen Arbeitsgruppe an der ursprünglich eingeschriebenen Universität so gut zu erklären, dass verständlich wird, wieviel Arbeit, Mühe, Schweiß, Tränen und oft auch Blut (ja, das ist wörtlich gemeint!) in jedem einzelnen Experiment steckt. Denn am Ende sind es nur die 40 Folien und 30 min des Abschlussvortrags, die ihnen einen Eindruck davon vermitteln können… Drückt mir die Daumen, dass es gut läuft, ich schreibe euch nächste Woche mehr dazu!