Was nützt es einer Person, wenn ich den Prozess der DNA Replikation erkläre, aber der Person nicht verständlich mache, warum dieser Prozess notwendig ist? Jede Person kann die ganze Maschinerie der Transkription & Translation auswendig lernen, aber spätestens nach der Klausur ist das auswendiggelernte Wissen weg. Wenn doch nur zumindest der Zweck dieser Prozesse hängenbleiben würde, wäre schon viel erreicht.

Ich habe letztens versucht, die Prozesse der DNA Replikation, Transkription und Translation einer Person zu vermitteln, die schon seit einer Weile keine Berührung mehr mit diesen Themen hatte.

Im Laufe meiner Erklärungsversuche wurde mir wieder vor Augen geführt, wie wichtig es ist, sich zu vergegenwärtigen, wer mein Publikum ist. Welches Wissen bringt es mit? Das ist entscheidend bei der Frage, wie ich einen Sachverhalt am besten vermitteln kann. Kennt ihr das: Als Experte in einem Thema passiert es oft, dass wir schnell einen Punkt der Frustration erreichen, wenn wir das Gefühl haben, unser Gegenüber würde unsere Erklärungen nicht verstehen? Wir müssen uns bewusst werden, dass die Problematik oft genug auf unsere Seite liegt: Wir haben nicht gelernt, das Publikum und sein Vorwissen in den Vordergrund zu stellen. Beim Erklären eines Sachverhalts ist die schwierigste Frage nicht die Frage des Gegenübers sondern die Frage, wie vermittle ich als Erklärende mein Wissen am besten an das derzeitige Publikum? Denn Schlussendlich geht es mir darum, nicht mein Wissen oder mich in den Vordergrund zu stellen, sondern die fragende Person.

Ich habe mal versucht, meine Erklärungen zu den Themen DNA Replikation, Transkription und Translation zu rekonstruieren und hier (in verbesserter Form) festzuhalten. Es wäre schön, wenn ihr mir eure Meinung dazu sagen könntet, vielleicht sogar eure eigene Version der Prozesse?

DNA Replikation:

Bevor wir ins Detail gehen, einige wichtige Fragen überhaupt:

Weißt du, was die DNA ist?

Stelle dir die DNA wie eine Bibliothek vor. Du betrittst die Bibliothek und siehst viele Regale. Aber in den Regalen sind anscheinend keine Bücher drin sondern etwas anderes. Du gehst auf das Regal mit der Nummer 15 zu und siehst, dass das Regal vollgestopft ist mit großen weißen Blättern, dicht an dicht. Du bist neugierig und ziehst vorsichtig ein großes Blatt heraus. Es ist ein Bauplan! Aber anstatt eines Bauplans eines Gebäudes zeigt dir dieser Bauplan, wie du braune Augen bekommst. Du legst den Bauplan zurück und gehst weiter zum Regal mit der Nummer 8. Hier ziehst du ein weiteres Blatt heraus und findest einen Bauplan der erklärt wie du es schaffst, 1.60 Meter groß zu werden.

So ungefähr kannst du dir die DNA vorstellen: Eine Riesenbibliothek mit vielen Bauplänen, in denen steht, wie der Körper gebaut wird. Die Baupläne stehen für die sogenannten Gene, von denen es sehr viele gibt. Die Gene sind aber nicht einfach irgendwo in der Bibliothek verstreut: sie sind geordnet und haben alle ihre Stammplätze.

Du gehst jetzt die ganzen Regale entlang und zählst die Nummern ab. Du zählst 46 Regale, aber je zwei nebeneinander stehende Regale sind mit derselben Nummer versehen, also finden sich nur die Zahlen 1-23 auf den Regalen wieder.

Du gehst auf die zwei Regale mit der Nummer 8 nochmal zu und schaust dir den Bauplan für deine Körpergröße in dem vorherigen Regal nochmal genauer an. An der gleichen Stelle im gegenüberliegenden Regal mit derselben Nummer ziehst du auch einen Bauplan heraus. Du hältst die beiden Baupläne nebeneinander und vergleichst sie miteinander. Beide sehen größtenteils gleich aus. Aber an einer Stelle sind sie etwas anders. Der eine Bauplan erklärte ja, wie du die Körpergröße 1.60 Meter erreichen kannst. Der andere Bauplan von der gegenüberlegenden Seite erklärt dir aber, wie du die Körpergröße 1.90 Meter erreichen kannst.

Wenn du die weiteren Baupläne aus den beiden Regalen mit der Nummer 8 vergleichst, wirst du sehen, dass an der gleichen Stelle aber im gegenüberliegenden Regal eine identische Kopie oder eine ähnliche Kopie mit einer kleinen Veränderung existiert. So ist es auch bei den anderen Regalen mit den gleichen Nummern.

So ist das mit der DNA in den meisten deiner Körperzellen. Die DNA ist die gesamte Bibliothek. Von den Genen gibt es immer zwei Kopien, eine Kopie ist in einem speziellen Regal, die zweite Kopie im gegenüberliegenden Regal. Von den Regalen gibt es 46, die aber immer paarweise angeordnet sind, so dass es also 2 x 23 Regale sind. Diese Regale sind ein Metapher für die sogenannten Chromosomen.

Wir Menschen haben 46 Chromosomen, die paarweise wie die Regale angeordnet sind. Bei den Menschen sind ungefähr 35.000 Gene bekannt. Wenn diese Bibliothek also deine DNA darstellt, befinden sich hier also 35.000 Baupläne und das in doppelter Ausführung, also 2 x 35.000 = 70.000 Baupläne!

Schon beeindrucken, oder? In fast jeder deiner Zellen findet sich so eine DNA-Bibliothek. Eine Ausnahme bilden deine Geschlechtszellen, also deine Eizellen oder Spermien. Hier findest du nur 23 Regale und jedes Gen ist nur in einfacher Ausführung da, also keine Kopie. Warum das so ist, erzähle ich dir später.

Du hast dir bestimmt schon mal in die Finger geschnitten. Bei so einer Verletzung gehen die Zellen kaputt. Dein Körper weiß sich aber zu heilen und nach kurzer Zeit verschließt sich die Wunde. Was hat der Körper nun gemacht? Er hat aus den alten intakten Zellen um die Wunde herum neue Hautzellen gemacht. Dabei haben sich intakte Zellen neben der Wunde geteilt: aus eins mach zwei! Damit das möglich ist und beide Zellen die selbe DNA, also die selbe Bibliothek besitzen, muss die Zelle ihre Bibliothek verdoppeln und auf die neuentstehenden Zellen aufteilen. Dieser Prozess nennt sich DNA Replikation und da sind wir schon bei der nächsten Frage:

Weißt du, was das Wort Replikation bedeutet?

Es bedeutet nichts anderes als kopieren. Das Wort ist angelehnt an das englische Wort replicate, also kopieren. Das Wort beschreibt den Vorgang, wie eine Zelle ihre DNA-Bibliothek verdoppelt.

Wozu müssen wir denn die DNA vervielfältigen?

Warum die DNA kopiert werden muss, habe ich dir im Beispiel oben erklärt. Viele deiner Körperzellen leben nicht ewig. Viele von ihnen haben sogar eine sehr kurze Lebensdauer. Deine Magenzellen leben z.B. maximal 2 Tage! Damit du aber nicht irgendwann ohne Magenzellen dastehst, muss dein Körper immer für Nachschub sorgen. Das schafft er, indem Zellen sich teilen. So hast du eine Zelle, die sich in zwei Magenzellen teilt. Damit die beiden neuen Zellen aber die selbe Information, also die selbe DNA-Bibliothek besitzen, muss diese Zelle ihre DNA-Bibliothek zunächst einmal verdoppeln und beim Teilen dann jeder der neu entstehenden Zellen je eine der Kopien der Bibliothek mit auf den Weg geben.

Damit die DNA verdoppelt wird, braucht es viele Mitarbeiter, die Fachleute sind, um die ganze Bibliothek exakt zu kopieren. Neben den Fachleuten gibt es auch Assistenten, die bei dem Kopieren helfen. So eine große Bibliothek zu kopieren ist nicht einfach und manchmal machen die Fachleute trotzdem Fehler. Damit der Fehler nicht einfach so an die zukünftigen Zellen weitergegeben wird, gibt es auch hier Fachleute, die die Arbeit mehrmals kontrollieren. Wenn sie einen Fehler entdecken, versuchen sie ihn zu korrigieren.

Wurde die ganze Bibliothek nun durch die vielen Helfer verdoppelt, kann die Zelle sich endgültig teilen und je eine der beiden Bibliotheken an die beiden neuen Zellen weitergeben.

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Zellteilung von P. Fernandez, M. Maier, M. Lindauer, C. Kuffer, Z. Storchova und A Bausch. Lizenz: Creative Commons Attribution 2.5 Generic; unverändert; Die Originaldatei ist hier zu finden.

Transkription & Translation

Transkiption

Wir haben jetzt verstanden, dass unsere DNA wie eine große Bibliothek ist, in der die ganzen Informationen u.a. für unseren Körperbau in Form von Bauplänen zu finden sind. Die Informationen sind wichtig, aber wie kommen wir nun zu dem Körper? Zum Beispiel: wie wird nun eine Magenzelle gemacht? So eine Magenzelle besteht ja schließlich nicht nur aus Bauplänen.

Stellen wir uns so eine Magenzelle wie eine Wohnung vor. Diese Wohnung hat mehrere Räume, sie hat Wände und zu einer Wohnung gehören auch Tische, Stühle, Lampen und viele weitere Möbelstücke. All diese Gegenstände, von den Wänden bis zum letzten Möbelstück müssen ja hergestellt werden. Die Informationen, wie sie hergestellt werden, befinden sich in den Bauplänen und diese Baupläne befinden sich in unserer DNA-Bibliothek.

Versuchen wir jetzt unsere Metapher von der DNA-Bibliothek auf eine Wohnung mit mehreren Zimmern zu übertragen. Zum Einrichten dieser Wohnung sind die Baupläne und damit die DNA-Bibliothek für dich das Wichtigste, denn ohne sie geht gar nichts. Damit nicht alles drunter und drüber geht und nicht jede Person hier reinpfuschen kann, muss die DNA-Bibliothek an einem sicheren Ort untergebracht und der Zugang eingegrenzt werden. Also nur ausgewählte Personen wie Bibliothekare dürfen hier rein! So eine Eingrenzung ist wichtig, sonst kann ja jede Person rein und in die Baupläne reinkritzeln oder fremde Baupläne in die Regale reinschmuggeln. Und wenn du jetzt in deiner DNA-Bibliothek beginnst, deine Möbelstücke oder das Material für deine Wand herzustellen, willst du nicht wissen, was für ein Chaos an diesem wichtigen Ort ausbrechen würde. Eine Baustelle willst du hier nun wirklich nicht haben. Also suchst du dir in der Wohnung (eine Metapher für unsere Zelle) einen Raum extra nur für deine DNA-Bibliothek aus und versiehst den Zutritt mit strengen Einschränkungen. Dieser Raum ist der Zellkern. In einer Zelle wie deiner Magenzelle wird die DNA-Bibliothek dort verwahrt.

Du verlässt jetzt den Zellkern und gehst in dein Wohnzimmer wobei du dir denkst, dass du hier ein paar Möbel brauchst. Für die Herstellung der Möbel hast du extra Fachleute angestellt. Aber diese Fachleute dürfen nicht den Raum mit deiner DNA-Bibliothek betreten. Die Fachleute brauchen aber zur Herstellung der Möbel die Baupläne, denn ohne sie wissen sie nicht, was du brauchst und wie der Gegenstand gebaut wird! Die Originalbaupläne in deiner DNA-Bibliothek willst du aber auch nicht einfach so hergeben. Was würde passieren, wenn die Originalbaupläne verloren gehen?! Nein, nein, hier läuft es nicht so wie bei einer gewöhnlichen Bibliothek, wo du ein Buch ausleihen kannst. Damit du den Originalbauplan immer in deiner Bibliothek hast, denkst du dir eine andere Strategie aus. Du machst eine Kopie nur von dem einen Bauplan, der gerade benötigt wird und diese Kopie gibst du den Fachleuten für die Herstellung der Möbel! Und hier kommen wir zur Transkription.

Die Transkription beschreibt den Vorgang, bei dem die Zelle eine Kopie von den Originalbauplänen (von den Genen) in der DNA-Bibliothek im Zellkern macht und diese Kopie aus dem Zellkern heraus bringt. Ähnlich wie du Möbel für die Wohnung brauchst, braucht die Zelle spezielle Proteine, z.B. eine Art „Scherenprotein“, das wie eine Schere funktioniert um andere Proteine zu schneiden. Im Zellkern ist der Bauplan für die Herstellung eines Scherenproteins in der DNA-Bibliothek vorhanden. Das Scherenprotein wird ja aber nicht im Zellkern hergestellt sondern außerhalb, sagen wir mal im Wohnzimmer. Also wird im Zellkern der Bauplan für das Scherenprotein kurz herausgeholt und kopiert. Der Originalplan wird feinsäuberlich wieder zurück ins Regal gelegt und die Kopie wird zum Wohnzimmer geschickt, damit die Fachleute wissen wie ein Scherenprotein gebaut wird. Und damit haben wir die Transkription auch schon grob erklärt.

Translation

Was danach folgt, ist ja logisch. Die Fachleute im Wohnzimmer bauen anhand der Kopie dein gewünschtes Möbelstück. Die Materialien hast du bereits im Wohnzimmer rumliegen, z.B. Holz, Polster, Kleber und und und.

Für unsere Zelle heißt das: Anhand der Kopie des Gens aus der DNA-Bibliothek wird ein Scheren-Protein hergestellt. Dafür werden Materialien verwendet, die in der Zelle bereits vorhanden sind. Das sind in diesem Fall Aminosäuren. Die hat die Zelle entweder schon vorher hergestellt oder manche, die sie nicht selber herstellen kann, durch Nahrung aufgenommen und die Aminosäuren aus der Nahrung in der Zelle zur Verfügung gestellt. So ist die Zelle in der Lage, viele Proteine herzustellen, die für ihre Funktionen wichtig sind. Schau dir z.B. die Wände einer Zelle an, die sogenannte Zellmembran. Eine Zelle hat ähnlich wie eine Wohnung eine Wand, die sie von der Umgebung und von anderen benachbarten Zellen trennt. Die Zellwand besteht aus Material, das von der Zelle andauernd hergestellt werden muss.

Erinnerst du dich an das Beispiel der Zellteilung? Wenn eine Zelle sich teilt, wird nicht nur die verdoppelte DNA-Bibliothek auf die neu entstehenden Zellen aufgeteilt. Die ursprüngliche Zelle teilt auch ihre Materialen wie die Zellmembran auf die neuen Zellen auf. Die zwei neuen Zellen haben also auch etwas von den Proteinen der ursprünglichen Zellmembran. Aber sie müssen selber noch etwas dazu beitragen und mehr Proteine für ihre neue Wand herstellen, sonst würden die Zellen bei jeder Teilung kleiner und kleiner werden. Und damit haben wir auch schon die Translation grob durch.

So weit zu den wichtigsten und grundlegendsten Informationen zu den Themen DNA-Replikation, Transkription und Translation.

Für diejenigen, die es bis hierher geschafft haben und noch einige interessante Details mitnehmen möchten, habe ich 3 weitere Punkte, die ihr euch vielleicht anschauen wollt.

Es geht um die Fragen nach

1. dem Grund, warum Eizellen und Spermien Gene nur in einfacher Ausführung und nicht in doppelter Ausführung haben und
2. dem 23. Regalpaar, das unser genetisches Geschlecht bestimmt
3. dem Grund, warum wir unterschiedliche Zellen haben, obwohl in jeder Zelle die selbe Information vorhanden ist.

Wenn ihr Lust habt, lest einfach weiter:

Warum haben Eizellen und Spermien nur 23 Chromosomen und die Gene in einfacher Ausführung?

Ich habe oben ja erwähnt, dass fast alle deine Körperzellen 46 Chromosomen haben, die paarweise geordnet sind, also 2 x 23 Chromosomen und deine Gene dadurch in zweifacher Ausführung bei dir vorhanden sind. Ausnahmen bilden Eizellen und Spermien. Sie haben nur 23 Chromosomen, von jedem Gen gibt es nur eine Kopie! In unseren Metaphern gesprochen: Wir haben nur 23 Regale, von jedem dieser Regale gibt es keine weitere Kopie, die Baupläne gibt es auch nur ein einziges Mal! Hier fand die Teilung in Eizellen und Spermienzellen so statt, dass jede Eizelle und jedes Spermium nur 23 Regale mit einfache Ausführung jedes Bauplans besitzt. Während der Teilung in Eizellen und Spermien wurde die DNA nicht verdoppelt. Es fand keine DNA Replikation statt. Das ist wichtig! Denn wenn eine Eizelle und ein Spermium zusammen kommen und ein Embryo daraus entsteht, werden die 23 Regale der Eizelle und die 23 Regale des Spermiums zusammen getan und das ergibt für den neu entstehenden Embryo wieder 46 Regale, die dann paarweise angeordnet werden. Würden die Eizellen weiterhin 46 Chromosomen haben und die Spermien auch, würde beim Verschmelzen der Eizelle und des Spermiums ein Embryo mit 92 Regalen entstehen und so ein Embryo ist gar nicht überlebensfähig!

Manchmal passiert es, dass ein spezielles Regalpaar bei der Teilung sich doch nicht trennt. Das kennen wir beim Down Syndrom, welches auch Trisomie 21 genannt wird. Hier haben sich bei einem der Elternteile in den Geschlechtszellen die zwei Regale mit der Nummer 21 nicht ordentlich getrennt. Wenn danach die Eizelle und das Spermium zusammen kommen, haben wir zwei Regale der Nummer 21 von dem einen Elternteil und ein Regal 21 von dem anderen Elternteil und somit im Embryo drei Regale mit der Nummer 21. Das Chromosom Nummer 23 ist eine der wenigen Ausnahmefälle, in denen es möglich ist, dass eine unvollständige Trennung der Regale zu einem lebensfähigen Embryo führt. Bei den meisten anderen Fällen ist der Embryo nicht überlebensfähig.

Chromosomenpaar 23 bestimmt u.a. unser genetisches Geschlecht

Nun kommen wir zu unserem Chromosomenpaar 23 bzw. den zwei Regalen mit der Nummer 23, die ja in unserer Vorstellung die Chromosomenpaare repräsentieren.

Je nachdem, ob du dir Zellen von Frauen oder von Männern ansiehst, wirst du zwei verschiedene Szenarien sehen. Bei Zellen einer Frau sehen die beiden Regale mit der Nummer 23 gleich aus. Sie unterscheiden sich nicht.

Bei Zellen eines Mannes sieht eines der beiden Regale viel kleiner aus und die Baupläne der beiden Regale sind auch nicht alle gleich. Die beiden Regale Nummer 23 stehen für die Geschlechtschromosomen. Sie bestimmen bis zu einem hohen Grad unser genetisches Geschlecht. Bei Frauen sprechen wir von zwei X-Chromosomen, bei Männern von einem X-Chromosom und einem Y-Chromosom.

Schauen wir uns eine andere Szene an: Ein Tatort, ein Verbrechen, die Täterin oder der Täter sind entkommen. Die Person hat lediglich eine Spur hinterlassen. Diese Spur kann aus Blut oder Hautzellen der verdächtigen Person bestehen. Hierzulande ist es im Rahmen von forensischen Ermittlungen erlaubt, die DNA-Bibliothek der verdächtigen Person zu untersuchen und das Geschlecht zu ermitteln. Dabei schauen die Forensiker nach, ob ein Y-Chromosom bzw. ein besonderer Bereich des Y-Chromosoms vorhanden ist oder nicht. Ist der Bereich aus dem Y-Chromosom nicht vorhanden, handelt es sich wahrscheinlich um eine Täterin, ist er aber vorhanden, handelt es sich wahrscheinlich um einen Täter.

In meinem letzten Satz habe ich jetzt oft das Wort wahrscheinlich benutzt. Das liegt daran, dass es bei den Ergebnissen lediglich um die Bestimmung des genetischen Geschlechts geht und nicht um das soziale Geschlecht. Aber auch das genetische Geschlecht ist eigentlich nicht so einfach zu definieren. Wenn ihr mehr dazu erfahren wollt, schaut euch den Artikel „Intersexualität: Die Neudefinition des Geschlechts“ von Claire Ainsworths an.

Und jetzt zu der interessantesten Frage überhaupt:

Warum entwickeln sich Zellen unterschiedlich trotz gleicher DNA-Bibliothek?

Wenn alle unsere Körperzellen dieselbe DNA-Information haben, warum haben wir dann so viele unterschiedliche Zellen? Woher weiß eine Zelle, dass sie eine Magenzelle ist und nicht eine Herzzelle, wo doch beide die gleiche DNA-Bibliothek besitzen? Woher weiß eine Nervenzelle, dass sie sich nicht wie eine Knochenzelle verhalten darf?

Schauen wir uns mal die DNA-Bibliothek einer Nervenzelle und einer Knochenzelle genauer an.

Zunächst einmal besuchen wir die DNA-Bibliothek der Nervenzelle. Beim Betreten der Bibliothek sieht erstmal alles so aus, wie du es auch von anderen DNA-Bibliotheken anderer Zellen kennst. Jetzt gehst du zu einem der Regale und dir fällt auf, dass an einigen Stellen die Baupläne viel dichter aneinander gequetscht sind als anderswo. Du versuchst einen Bauplan aus diesem dichten Bereich heraus zu nehmen, aber egal wie sehr du ziehst, du schaffst es nicht. Du kannst dir diese Baupläne einfach nicht herausnehmen und sie lesen! Probeweise gehst du zu einem Bereich, wo die Baupläne nicht so dicht an dicht liegen und versuchst, einen heraus zu nehmen. Es gelingt dir ohne Mühe. So sieht es auch bei anderen Regalen in der DNA-Bibliothek der Nervenzelle aus. Es gibt einfach Bereiche in den Regalen, da sind die Baupläne so extrem zusammen gepackt, dass du sie nicht herausnehmen und lesen kannst. Du versuchst, an den Bauplänen hinter sie zu greifen und ertastest eine Art Klammer, die sie zusammen zu quetschen scheint und nur in den gepackten Bereichen zu spüren ist. Du merkst dir die dichten Stellen und gehst jetzt zu der DNA-Bibliothek der Knochenzelle. Auch hier sieht erstmal alles wie gewohnt aus, aber wenn du zu den Stellen gehst, die in der DNA-Bibliothek der Nervenzelle doch dich gepackt waren, merkst du, dass diese Stellen hier lockerer verpackt sind, so dass du die Baupläne ganz leicht herausnehmen kannst. Dafür sind jetzt andere Stellen in dieser DNA-Bibliothek extrem dicht gepackt.

So verhält es sich bei deinen Zellen auch. Eine Knochenzelle braucht nicht alle Informationen aus der Bibliothek. Informationen, die wichtig sind für Nervenzellen oder Herzzellen, sind in einer Knochenzelle so dicht gepackt, dass eine Knochenzelle diese Informationen gar nicht lesen kann. Ähnlich wie bei den Klammern, die die Baupläne in unserer Metapher dicht verpackt und unzugänglich halten, besitzen Zellen auch Methoden, wie sie DNA-Bereiche dicht verpacken und damit unzugänglich machen können. Die Zelle kann diese Baupläne gar nicht herausnehmen und sie ablesen. Und weil diese Informationen nur für andere Zellen ablesbar sind, kann die Knochenzelle gar nichts damit anfangen und liest nur die Informationen, auf die sie Zugriff hat. Diese Informationen ohne eine Zugriffseinschränkung geben einer Knochenzelle die Anweisung, wie die Zelle sich als Knochenzelle zu verhalten hat. Genauso verhält es sich mit anderen DNA-Bibliotheken anderer Zelltypen. Die DNA-Bibliothek ist zwar in allen Zellen gleich, aber die Zellen haben nicht Zugriff auf alle Informationen und können nicht alle Baupläne ablesen. So lesen sie nur das, was für sie erreichbar ist und verhalten sich auch so, wie ihnen diese restlichen Informationen das verordnen. Hier sind wir jetzt in einem spannenden Bereich der Genetik angelangt, der sich Epigenetik nennt und an dem gerade viel geforscht wird

Ich habe mir mal die Zeit genommen, nach Herz-Lungen-Wiederbelebung, Herzmassage, CPR, Wiederbelebung etc. in Google Bilder zu suchen. Ist euch auch schon mal aufgefallen, dass die auf dem Boden liegenden „betroffenen“ Personen meist Männer waren? Oder wenn sie Frauen waren, im Vergleich zu den männlichen Vorführpersonen immer oben vollständig bekleidet waren, während männliche Vorführpersonen häufig mit nacktem Oberkörper gezeigt werden? Frauen werden höchstens im Badeanzug gezeigt, oftmals als Beispiel einer Ersthelfervorführung von Rettungsschwimmern. Und die Modellpuppen scheinen ja alle nur einen männlichen Torso zu haben…

Vielleicht wird es euch dann nicht wundern, von einer Studie zu hören, deren vorläufige Ergebnisse darauf hindeuten, dass Frauen im Vergleich zu Männern im öffentlichen Raum weniger oft eine Herz-Lungen-Wiederbelebung von Passanten bekommen. Vielleicht erahnt ihr auch schon bereits die Gründe dafür.

Aber zunächst einmal für den Laien:

Für eine Wiederbelebungsmaßnahme ist es notwendig, das Herz durch Druck auf das Brustbein der betroffenen Person in Richtung Wirbelsäule zu pressen. Hierdurch wird der Druck im Brustkorb so erhöht, dass das Blut aus dem Herzen in den Kreislauf gepresst wird. Diese Herzdruckmassage dient dazu, den Blutfluss aufrecht zu erhalten, um den Körper mit dem im Blut befindlichen Sauerstoff zu versorgen. Ist der Blutfluss lange unterbrochen, können Organe unwiderrufliche Schäden davon tragen. Ein Sauerstoffmangel von 3 Minuten reicht schon aus und das Gehirn zeigt irreversiblen Schaden.

Nun haben viele von uns im Erste-Hilfe-Kurs an Modellpuppen üben dürfen, wie eine Wiederbelebungsmaßnahme funktioniert und fühlen uns mehr oder weniger gewappnet für einen eventuellen Fall im Alltag.

Dennoch scheint in Fällen, in denen Frauen eine Wiederbelebungsmaßnahme benötigen, etwas schief zu laufen:

Auf der Konferenz American Heart Association’s Scientific Sessions in November 2017 wurden die vorläufigen Ergebnisse einer Studie zusammengefasst, wonach Frauen im Vergleich zu Männern im öffentlichen Raum weniger oft eine Herz-Lungen-Wiederbelebung von Passanten bekommen.

Die Wissenschaftler haben dazu um die 19.000 Fälle zwischen 2011 und 2015 untersucht. Die Daten für die Studie entstammten aus dem Netzwerk Resuscitation Outcomes Consortium, ein Zusammenschluss regionaler klinischer Zentren der USA und Kanada, die sich u.a. mit präklinischem plötzlichem Herzstillstand und -trauma beschäftigen.

Männer erhielten im öffentlichen Raum demnach in 45% der Fälle eine Herz-Lungen-Wiederbelebung von Umstehenden, Frauen lediglich in 39% der Fälle. Eine rechtzeitig durchgeführte Herz-Lungen-Wiederbelebung hat großen Einfluss auf die Überlebenschancen einer Person. In den vorliegenden Fällen zeigten Männer nach dem Entlassen aus dem Krankenhaus eine 23% höhere Überlebenswahrscheinlichkeit als Frauen.

Wird eine Herz-Lungen-Wiederbelebung im privaten Raum durchgeführt, sinkt der Unterschied zwischen den Geschlechtern: 35% der Frauen und 36 % der Männer erhalten eine Wiederbelebungsmaßnahme im privaten Raum wie dem eigenen Zuhause.

Wie kommt es nun zu diesem Verhaltensunterschied im privaten und öffentlichen Raum? Warum erhalten Frauen weniger oft eine Herz-Lungen-Wiederbelebung?

Zwar fehlen bis dato genauere Untersuchungen zum Verhalten der Passanten, aber einige Hypothesen lassen sich jetzt schon in Hinsicht auf die geschlechtsbezogenen Verzerrungseffektstellen (Gender Bias) formulieren.

Im Erste-Hilfe-Kurs an Modellpuppen haben wir es ja gelernt: Für eine Herz-Lungen-Wiederbelebung ist es notwendig, die Hand auf dem Brustbein zu positionieren. Ideal wäre es, wenn der Oberkörper der betroffenen Person von störenden Kleidungsstücken frei gemacht wird.

Was wir vielleicht aber nie bewusst gedacht haben: Wie läuft es bei Frauen ab? Wohin mit meinen Händen in so einem Fall? Welche Oberteile entferne ich für den Fall der Fälle?

Die Modellpuppen im Erste-Hilfe-Kurs haben i.d.R. einen männlichen Torso. Dies kann dazu beitragen, dass Menschen in Ernstfall zum ersten Mal mit solchen und ähnlichen Fragen konfrontiert werden. Solche Verunsicherungen können eventuell zu einer verzögerten oder falschen Reaktion führen, im schlimmsten Fall sogar zum Ausbleiben einer Hilfeleistung.

Die Hände müssen nämlich zwischen den Brüsten positioniert werden. Unter Umständen berühren die Finger die Brustwarzen. Na, was war das? Habe ich etwa gerade die Rädchen für moralisch richtiges Verhalten gehört, die sich bei euch schon in Bewegung gesetzt haben?

Und überhaupt, die Frage nach dem Entfernen der BHs: Muss das sein?

Wird eine Wiederbelebungsmaßnahme mit Händen durchgeführt, ist es kostbare Zeit, die verstreicht und Organe währenddessen Schaden nehmen, wenn ihr euch die Zeit zum Entfernen der Oberbekleidung nehmt. Mitunter um die 30 Sekunden. 30 Sekunden von den 3 Minuten, bei denen das Gehirn schon irreversiblen Schaden nimmt!

Habt ihr aber einen automatisierten externen Defibrillator (AED) zur Hand, steht es bereits in den Instruktionen, dass Oberbekleidung (mit der beigefügten Schere) entfernt werden soll, da die Pads direkten Hautkontakt benötigen. Ich habe einige Videos gesehen, bei denen die Pads direkt auf die Brustwarzen geklebt werden oder die Brüste und damit die Position der Pads gänzlich zensiert werden. Beim Erste-Hilfe-Kurs werden diese Probleme selten angesprochen und wenn wir danach recherchieren, sind anscheinend aus Gründen der Diskretion die Pads falsch positioniert oder der Brustbereich zensiert… Und die Zeichnungen der AED-Pads zeigen meist wieder mal eine männliche Figur.

Die männlichen Torsos der Modellpuppen, die männliche Darstellungsform auf AED-Pads, die falsche oder unzureichende Vorführung in Videos… All das gepaart mit unseren bereits in der Gesellschaft verankerten Vorurteilen und Tabus bezüglich der entblößten weiblichen Oberkörper können unser Schamgefühl und unsere Unsicherheit in überlebenswichtigen Situationen verstärken.

Was kann nun dabei helfen, die Überlebenschancen von Frauen, die eine Herz-Lungen-Wiederbelebung benötigen, zu erhöhen?

Eine bewusste Auseinandersetzung mit der Thematik ist unerlässlich.

Es können bereits kleine Anstrengungen unternommen werden wie z.B. eine weitere Zeichnung eines weiblichen Oberkörpers auf AED-Pads.

Im Erste-Hilfe-Kurs sind in der Regel 2 Modellpuppen oder mehr zur Demonstrationszwecken vorhanden. Hier wäre schon viel damit getan, auch weibliche Torsos einzuführen und an beiden zu üben.

Bezieht bitte zum Zwecke einer Demonstration in Videos neben Männern als Vorführpersonen auch Frauen als Vorführpersonen mit ein. Verzichtet bitte auf eine falsche und zur Diskretion zensierte Durchführung bei einem nackten Oberkörper: statt den Oberkörper zu zensieren, kann eventuell das Gesicht der Person zensiert werden, um die Identität der Person geheim zu halten.

Neben der Beobachtung, dass Frauen seltener eine Herz-Lungen-Wiederbelebung erfahren, existieren weitere Befunde, dass Frauen weniger überlebenswichtige Behandlungen nach einem Kreislaufstillstand zugutekommen, z.B. Koronarangiographie oder Angioplastie¹.

Und obwohl viele Frauen an Herzerkrankungen leiden, sind lediglich 1/3 aller Studienteilnehmer zur Untersuchung von Herzerkrankungen weibliche Probanden. Hier müssen klinische Studien mehr Anstrengungen unternehmen, um eine solide Datenbasis zu schaffen² und diese Diskrepanz zu beseitigen.

¹ Garcia M, Mulvagh SL, Merz CNB, Buring JE, Manson JE. Cardiovascular Disease in Women: Clinical Perspectives. Circulation research. 2016;118(8):1273-1293. doi:10.1161/CIRCRESAHA.116.307547.

² Kim LK, Looser P, Swaminathan RV, et al. Sex‐Based Disparities in Incidence, Treatment, and Outcomes of Cardiac Arrest in the United States, 2003–2012. Journal of the American Heart Association: Cardiovascular and Cerebrovascular Disease. 2016;5(6):e003704. doi:10.1161/JAHA.116.003704.

Der rein marin vorkommende Organismus Trichoplax adhaerens ist die bisher einzige anerkannte Art des Stammes der Placozoa (Scheibentiere) und zählt zu den basaleren Metazoen. Die phylogenetische Position der Placozoa innerhalb der Metazoen ist jedoch umstritten. Aufgrund ihrer simplen Morphologie wurden Placozoa lange Zeit an der Basis der Eumetazoen eingeordnet, wobei diese Hypothese von einer stufenweisen Evolution von einfachen bis hin zu komplexer aufgebauten Organismen ausgeht (Abb. 1a). Eine weitere Hypothese, verteidigt von der Arbeitsgruppe um Schierwater in Hannover, platziert die Placozoa an der Basis der Metazoa und geht von einer frühen Aufspaltung der beiden Schwestergruppen, den Triploplasten und den Diploplasten, und einer folgenden parallelen Evolution der beiden Schwestergruppen aus, wobei die Placozoa die basalere Position neben den Schwämmen, den Ctenophoren und den Cnidariern innerhalb der Diploblasten einnehmen (Abb. 1b).

Der Köperbauplan von Trichoplax adhaerens ist einfach aufgebaut (Abb. 3). Die Individuen besitzen ein „unteres“ (dem Substrat zugewandtes) und ein „oberes“ (dem Wasser zugewandtes) Epithel, wobei eine orale-aborale bzw. eine dorso-ventrale Achse nicht eindeutig existiert. Strukturen wie ein Nervensystem, ein Verdauungssystem oder gar Organe und Muskulatur sind nicht vorhanden. Obwohl das Genom für Proteine der extrazellulären Matrix und der Basallamina kodierende Gene aufweist, konnten diese Strukturen derzeit nicht nachgewiesen werden. Möglicherweise besitzt Trichoplax eine extrazelluläre Matrix, welche ein nicht-traditionelles Erscheinungsbild besitzt und mit derzeitigen Methoden nicht nachweisbar ist (Srivastava et al., 2008).

Das obere Epithel wird von Deckzellen und vereinzelt von Glanzkugeln gebildet, deren Funktion derzeit noch unbekannt ist. Eventuell dienen die Strukturen der Verteidigung bzw. zur Abwehr von Fressfeinden oder ähneln neurosekretorische Zellen und haben Einfluss auf Lokomotion und Fressverhalten der Tiere. Das untere Epithel wird von birnenförmigen Drüsenzellen und von cilientragenden Zylinderzellen gebildet. Zwischen den beiden Epithelien befinden sich kontraktile Faserzellen, welche sowohl Charakteristika von Muskelzellen als auch von Nervenzellen aufweisen, weshalb vermutet werden kann, dass es sich bei ihnen um Vorläufer eines rudimentären Nervensystems handeln könnte. Neuere Studien zeigen neben den vier bisher beschriebenen somatischen Zelltypen mehrere Subtypen von Faserzellen, welche in mindestens drei Schichten zwischen den Epithelien angeordnet sind (Guidi et al., 2011; Smith et al., 2014).

Trichoplax Individuen zeigen primär eine vegetative Fortpflanzung durch Zwei- bzw. Dreiteilung (Abb.4a, b)oder durch Abschnürung bzw. Knospung von einem kleinen Teil des Körpers.

Eine sexuelle Reproduktion konnte nur unvollständig und nur bei degenerierten Individuen beobachtet werden (Eitel et al., 2011). Trichoplax Individuen können sowohl männliche als auch weibliche Gameten bilden. Zwar konnten mit Hilfe von Spermien-spezifischen Markern mutmaßliche Spermienzellen identifiziert werden, jedoch ist die Identifikation als Spermienzellen bislang nur unzureichend belegt. Die Bildung von Oocyten konnte schon früh beobachtet werden, jedoch zeigten Beobachtungen, dass die befruchtete Eizelle nach dem Erreichen des 128-Zell-Stadiums abstarb, da sich die DNA trotz fehlender Zellteilung vervielfältigte und der Nukleus infolgedessen platzte. Daher ist über die weitere embryonale Entwicklung noch nichts bekannt.

Literatur

-Blackstone NW. 2009. A New Look at Some Old Animals. Plos Biology 7: 29-31.

-Eitel M, Guidi L, Hadrys H, Balsamo M, Schierwater B. 2011. New Insights into Placozoan Sexual Reproduction and Development. PLoS ONE 6(5): e19639. doi:10.1371/journal.pone.0019639.

-Eitel M, Osigus H-J, DeSalle R, Schierwater B. 2013. Global Diversity of the Placozoa. PLoS ONE 8(4): e57131. doi:10.1371/journal.pone.0057131

-Guidi L, Eitel M, Cesarini E, Schierwater B, Balsamo M. 2011. Ultrastructural Analyses Support Different Morphological Lineages in the Phylum Placozoa Grell, 1971. Journal of Morphology 272: 371-378.

-Smith CL Varoqueaux F, Kittelmann M, Azzam RN, Cooper B, Winters CA, Eitel M, Fasshauer D, Reese TS. 2014. Novel Cell Types, Neurosecretory cells, and Body Plan of Trichoplax adhaerens. Current Biology 24(14), 1565–1572.

-Srivastava M, Begovic E, Chapman J, Putnam NH, Hellsten U, Kawashima T, Kuo A, Mitros T, Salamov A, Carpenter ML et al. 2008. The Trichoplax genome and the nature of placozoans. Nature 454: 955-960.

Im folgenden findet ihr hier meine Masterarbeit. Die Arbeiten dazu habe ich am Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie der Uniklinik RWTH Aachen unter Aufsicht von Rudolf Leube und Reinhard Windoffer durchgeführt. Ich stelle meine Arbeit hier hoch, in der Überzeugung, dass das an der Universität erlangte Wissen ein Gemeingut darstellt, welches der breiten Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt werden muss. Forschung, wie sie an Universitäten durchgeführt wird, ist nur mit Hilfe öffentlicher Zuwendungen z.B. durch entsprechende Förderprogramme der Regierung möglich, welche steuerlich finanziert werden. Aus diesem Grund hat die Öffentlichkeit ein Recht auf den freien Zugang zu dem erlangten Wissen und dieses Wissen sollte ihm nicht durch das Closed Access Monopol akademischer Verlage vorenthalten werden können! Wissen, das mit Hilfe gesellschaftlicher Mittel gewonnen wurde, sollte nicht privatisiert werden dürfen, was heute in vielen Fällen faktisch der Fall ist. Durch das Hochladen dieser Arbeit möchte ich meinen Dank an all die Menschen zum Ausdruck bringen, welche mir diese wundervolle Chance ermöglicht haben, an der Forschung beteiligt zu sein. Danke!

I Abstract
Cells are highly sensitive to physical and mechanical cues arising within the microenvironment, which have important effects on cellular processes and subsequent biological responses. The cytoskeleton plays a pivotal role in sensing biomechanical cues and translating it into biochemical signals but it is also of vital importance as a stress-bearing structure for maintaining cell integrity and stability by reorganizing single cytoskeletal elements upon mechanical stimulation. The keratin intermediate filament network contributes to the mechanical resilience of epithelial cells by undergoing a continuous cycle of remodeling in response to mechanical forces. Alterations of the keratin dynamics are difficult to quantify in cells grown under classical culture conditions since the cell shape is transitory due to uncontrollable cell polarity, migration and division. Adhesive micropatterns enable control over cell shape and function. This work explores the possibility to manipulate cell shape and size through cell micropatterning techniques in order to enable an easier quantification of the keratin filament distribution.

In the course of the experiments, stencil patterning was established as the preferred method of choice due to its superior performance in fabricating accurately shaped micropatterns with a uniform and homogeneous protein coating. Micropatterns with different sizes and shapes were designed and the optimal sizes and shapes for a high yield of single cells of selected cell lines was ascertained. The results obtained from normalized cells indicate that the keratin intermediate filament network does not respond to local geometrical cues because differently shaped cells revealed similarities in the average distribution of the keratin intermediate filaments. Nonetheless, the results demonstrate the utility of cell micropatterning for quantitatively assessing the contribution of the cytoskeleton to cellular behavior. The establishment of stencil patterning and the subsequent results of this work motivate further extensive investigations of the keratin intermediate filament network, as well as its interplay with other cellular components.

[nextpage title=”1 Introduction”]

1 Introduction
In recent years, it has become increasingly evident that physical and mechanical cues generated intrinsically within the cell in response to its microenvironment, and extrinsic cues imposed upon the cell by the microenvironment are as critical as biochemical cues in regulating cellular structure and function (Fletcher and Mullins, 2010; Hersch et al., 2013; Janmey and McCulloch, 2007; Krieg et al., 2008; Provenzano and Keely, 2011; Théry et al., 2005).
Cells are able to sense their microenvironment and its variances through a vast arsenal of intracellular and extracellular receptors, which upon activation can induce different downstream signaling events including the activation of signaling networks with subsequent changes in gene expression, recruitment of biomolecules and reorganization of the cytoskeleton,. a scaffolding composed of three types of cross-linked filamentous networks together ensuring intracellular processes, structural integrity, and cell motility: actin microfilaments (MF), microtubules (MT), and intermediate filaments (IF).

1.1 Intermediate filaments
The human IF protein family is encoded by approximately 70 genes (Hesse et al., 2001), classified into six distinct types based on their similarities in gene structure or sequence homology and are expressed in a tissue type-dependent, cell type-dependent, differentiation program-dependent, and context-dependent fashion. IFs have been shown to play a crucial role in numerous cellular processes for maintaining cell and tissue integrity and have been implicated in playing a key role in stress response (Hyder et al., 2011; Kim and Coulombe, 2007; Pallari and Eriksson, 2006).
The most prominent types of IFs in epithelial cells are type I (acidic) keratins and type II (neutral-basic) keratins. Equal amounts of type I and type II polypeptides form heterodimers, which assemble into obligate heteropolymers. The keratin intermediate filaments (KIFs) form a cytoplasmatic network braiding the nucleus and extending out to the cell periphery. They are connected to the ECM through an anchorage to hemidesmosomes and to adjacent epithelial cells through desmosomes, thus ensuring the integrity and mechanical stability of both the single epithelial cells (Ramms et al., 2013) and of the epithelial tissue as it is evident in a number of keratin-associated disorders, where specific keratin mutations predispose cells to cellular stress and to epidermal fragility (Lane and McLean, 2004; Rugg and Leigh, 2004), resulting in various skin diseases such as Epidermolysis bullosa (Coulombe et al., 2009; Russel et al., 2004). Yet despite the importance of IFs for the maintenance of the biomechanical integrity of cells and tissue, their contribution to intracellular mechanics mostly remains unknown. Studies exploring the mechanical properties of IFs have shown that single IFs are quite soft, strikingly extensible, and withstand greater mechanical deformation than either microtubules or actin filaments (Fudge et al., 2003; Fudge et al., 2008; Janmey et al., 1991; Kreplak and Fudge, 2007). Cells in epithelia are exposed to tremendous mechanical stresses, for example frictional forces or strain, and as the predominant cytoskeleton in epithelial cells KIFs prove to be of great importance for the biomechanical integrity and stability of epithelial cells in response to mechanical resilience. Epidermal keratinocytes lacking type I and type II keratins, respectively, are significantly softer and less viscous than WT cell lines (Ramms et al., 2013).
The contribution of both actin and microtubules to mechanical resilience of cells and their polarity, the dynamics of their assembly and the associated motors and regulatory proteins have been investigated in great detail (Blanchoin et al., 2014, Fletcher and Mullins, 2010). Both actin and MT networks are composed only of one highly conserved globular protein, actin and tubulin, respectively. The basis for the remodeling of both networks is the asymmetry of the subunits and their dependency on chemical energy derived from hydrolysis. In contrast, the molecular mechanisms governing the polymerization of IFs and their dynamics are not well understood but its uncovering is of vital importance to understand cellular function and various human genetic disorders. IF self-assembly does not require chemical energy and due to the symmetric composition of their tetrameric subunits IFs lack polarity. High-resolution time-lapse imaging of cells transfected with fluorescently tagged keratin revealed a high degree of keratin network dynamics in cultured cells, enabling the establishment of a reference model for the KIF assembly and disassembly, termed as the keratin cycle (Windoffer et al., 2011). The keratin cycle (Fig. 1) is subjected to a protein biosynthesis-independent turnover and begins with the nucleation of soluble keratin particles, referred to as KIF precursors, in the cell periphery in close vicinity to focal adhesions followed by elongation, subsequent integration into pre-existing peripheral KIF networks and bundling, revealing an inward-directed movement, which is proposed to rely mainly on actin microfilaments but also on microtubules. Some KIFs disassemble into soluble subunits that diffuse throughout the cytoplasm and can be re-utilized for another round of KIF assembly. Other KIFs exit the keratin cycle of assembly and disassembly and mature into a stable network braiding the nucleus and are anchored to hemidesmosomes and desmosomes, resulting in an increased mechanical resilience of cells (Strnad et al., 2002).

Recent advances towards image analysis methods have been made to determine the speed and direction of KIF motion and to identify locations of KIF polymerization and depolymerization at subcellular resolution (Moch et al., 2013). Put together, the keratin cycle of assembly and disassembly and the keratin motion analysis yield a strong model, which provides a framework to identify regulatory proteins altering the cycle and to investigate keratin modifications and the influences of mechanical forces on the keratin cycle and the cell.
In order to measure keratin dynamics and its variances after alternations of experimental setups attempts have been made for conventional 2D cell culture systems to improve the comparability of single cells by converting recorded single cell images into idealized round cells, thus subtracting out variances in cell morphology (Moch et al., 2013). Unfortunately, such sophisticated cell shape normalization techniques are prone to errors that may occur in normalizing migrating or contracting cells, are only suitable for round cells and labor extensive. Several methods have been developed to overcome these obstacles, cell micropatterning being one of the most promising developments enabling the manipulation of cell architecture, cell-extracellular matrix (ECM) and cell-cell interactions.

[nextpage title=”1.2 Cell micropatterning: a tool to regulate cell shape”]

1.2 Cell micropatterning: a tool to regulate cell shape
Cell micropatterning refers to a technique within cell culture methods whereby the assembly of ECM-proteins e.g. fibronectin (FN) on a specific surface is controlled in order to achieve an accurate positioning of cells and control over cell size and spatial arrangement. This requires the ability to fabricate adhesive regions which mediate cell attachment and non-adhesive regions preventing cell attachment. Adhesive regions, commonly called micropatterns, can be fabricated in different shapes and sizes and can have a resolution reaching micro-scale.
One of the techniques most used in order to fabricate micropatterns on a planar substrate is micro-contact printing (µCP), in which a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp is fabricated based on a replica molding process by casting the liquid prepolymer of PDMS over a rigid master with patterned structures. After curing, the PDMS stamp is peeled off the mold, inked with a protein of choice and transferred onto the surface of a planar substrate by placing the microstructured, inked surface of the stamp in contact with the substrate. Upon removing the stamp, the desired pattern is left behind on the surface (Fig. 2 a). Alternatively, a stencil containing through holes can be used to fabricate micropatterns. The stencil can be fabricated either by casting a thin film of the liquid material to be used directly on the master without covering it wholly so that through holes can form or by depositing a curable material on the edges of a PDMS stamp placed on a planar substrate. Via capillary suction the gaps between the stamp and the substrate is filled. After curing and the removal of the stamp, the stencil can be peeled off and applied to the final substrate to be used. Adhesive proteins deposited on top of the stencil can come in contact with the underlying substrate only at regions left exposed by the though holes, resulting in the formation of adhesive micropatterns (Fig. 2 b).

The protein of choice can range from adhesive ECM proteins, e.g. fibronectin, collagen or laminin to amine-terminated self-assembled monolayers (SAMs) or Arg-Gly-Asp (RGD) peptide.
Upon seeding cells on a micropatterned substrate cells adapt a similar shape and size as the adhesive micropatterns thus enabling the manipulation of cell architecture, cell-ECM and cell-cell interaction.
In the past decades it has been revealed that cell morphology regulate different cellular processes like differentiation and cell fate, cell cycle control, proliferation, apoptosis and migration (Chen et al., 1997; de Juan-Pardo et al., 2006; Huang et al., 1998; Huang and Ingber, 2000; Ingber et al., 1995; LeDuc and Bellin, 2006, Parker et al., 2002). For example, Chen et al. (1997) demonstrated that human and bovine capillary endothelial cells were limited from spreading when micropatterns decreased in size and that cell fate shifted from growth to apoptosis, regardless of the type of adhesive protein used to promote attachment. Recent studies demonstrate how far-reaching geometric influences can be: It has been hypothesized that changes in cell architecture and associated changes in nuclear shape cause changes in chromatin structure and organization and thus alternating transcriptional activity. Stiles et al. (2013) aimed to uncover the influence of different cell shapes on global gene expression patterns of human coronary artery endothelial cells. Stiles and colleagues shown that morphological restriction in general significantly affect global gene expression patterns compared to non-restricted cells. These and many other examples demonstrate the influence of the extracellular physical environment in regard to cell response. Apart from their usefulness in exploring alternations in cellular morphology and physiology adhesive micropatterns ensure reproducibility, enable the detection of drug effects and facilitate automated image acquisition and analysis.

[nextpage title=”1.3 Objective”]

1.3 Objective
The objective of this work was to establish a cell micropatterning method that warrants reproducible cell shape, enabling a fast and accurate quantification of cytoskeletal organization. In order to achieve this goal, following major issues were addressed:
-Micropatterns with different shapes and sizes were designed and fabricated.
-µCP and stencil patterning were tested and compared in regard to their performance in fabricating micropatterns and in printing a uniform protein coating.
-The behavior of two selected cell lines was observed on micropatterned substrates.
-The optimal micropattern size and shape for a high yield of single cells was detected.
-The KIF distribution was assessed in normalized cells.
-Heat maps were generated for normalized cells.

[nextpage title=”2 Materials and Methods”]

2 Materials and Methods
Given the complexity and the extremely wide scope of this part, I decided to leave out the description of the materials. Whoever would like to know the exact details, don’t hesitate to contact me! I will forward you the details with pleasure. Please write a message by means of the contact form on my website.

2.2 Methods
2.2.1 Lithographic techniques
2.2.1.1 Fabrication of photolithography mask
The following method was done in cooperation with the Institute of Complex Systems 7: Biomechanics at the Jülich Research Centre. Different micropatterns for single cell analysis and bowtie-shaped micropatterns for cell-cell contact analysis were designed using the CleWin software.
The micropatterns were written on a blank photomask coated with a chromium layer and the negative photoresist layer SAL 601 by using the electron-beam lithograph EBPG-5H. The post-exposure bake of photomask was performed for 2 minutes at 105°C. Uncross-linked photoresist was removed using a 1 to 2 dilution of AZ 400K in DI water. Photomask was hard-baked for 15 min at 100°C, 15 min at 130°C and 15 min at 150°C successively. To remove residual layers of photoresist areas photomask was descummed for 10 to 120 s. Wet etching followed for 1 min in a chrome etching solution with a subsequent wash step in DI water. Finally, photomask was dried under a stream of nitrogen gas and exposed to oxygen plasma.

2.2.1.2 Fabrication of microstructured silicon master
The following method was performed by the Institute of Complex Systems 7: Biomechanics at the Jülich Research Centre. A silicon wafer was preheated at 180°C for 30 min and overlayed with a 25 µm thick layer of SU-8-25 photoresist (Fig. 3). Subsequently, the photoresist layer was soft-baked for 2 min at 65°C followed by slow ramp heating to 90°C within 5 min and additional baking of the photoresist at 90°C for 2 min. Using ultraviolet-photolithography at 346 nm with a source power of 7 mW for 25 s, the structures of the photolithography mask were transferred into the photoresist layer. The wafer was post-baked for 1 min at 65°C followed by slow ramp heating to 90°C within 5 min and additional baking for 1 min at 90°C. Uncross-linked photoresist was removed using SU-8 developer for 6 min. Finally, the photoresist was hard-baked for 30 min at 180°C. The SU-8-25 wafer was then silanized by exposure to vapor of FDTS in vacuum for 30 min at room temperature in order to prevent it from adhering to the PDMS during stamp fabrication.

2.2.2 Micropatterned substrate fabrication
2.2.2.1 Micro-contact printing
The first step for the fabrication of microstructured substrates using the µCP method consists of the fabrication of a microstructured master (see 2.2.1.2). The silicon master was cleaned under a stream of nitrogen. Sylgard® 184 Silicone Elastomer Base and Sylgard® 184 Silicone Elastomer Curing agent were mixed in a 10:1 ratio by thoroughly stirring. After removing air bubbles by degassing the solution in a vacuum desiccator the elastomer was poured over the master and cured at 60°C for 2 h (Fig. 4). The elastomer was peeled off the silicon master and small stamps were excised from the regions of interest. A drop of 50 µg/ml FN in PBS or 45µg/ml Collagen I in acetic acid mixed with 0.3% of an antibody of choice in PBS and acetic acid respectively was placed onto the microstructured surface of the PDMS-stamp. The ink was incubated for 1 h at RT. Subsequently, the ink drop was aspirated and the inked surface dried under a stream of nitrogen gas for 30 s. The PDMS-stamp was inverted and placed onto a gamma irradiated glass coverslip of a glass bottom dish immediately for 3 s and 30 min respectively. A 2 g weight was placed onto the PDMS-stamp in order to promote good contact with substrate and to stabilize the construct. The construct was carefully disassembled. Non-printed areas were blocked with a 1% Pluronic® F-127 in ddH2O for 1 h at 4°C in order to prevent cell adhesion. Subsequently, the substrate was carefully rinsed tree times with PBS.

2.2.2.2 Stencil patterning
In order to fabricate microstructured substrates through the usage of stencils PDMS-stamps were fabricated as described above (see 2.2.2.1). In the first step, coverslips were spin coated with a thin layer of PDMS (base to curing agent 10:1) for 7 s at 2500 rpm. Coated coverslips were mounted on the outer side of culture dishes with holes of approx. 20 mm diameter in a leak proof manner, the coated side facing the interior part of culture dishes. PDMS was cross-linked for 16 h at 60°C. Alternatively, cross-linked PDMS-coated coverslips were places in microwell plates. In the second step, PDMS-stamps were placed onto a sellotape adhered to a glass slide. Uncured epoxy resin was placed at the stamp boundaries and dispensed by capillary suction between stamp and sellotape (Fig. 5). Curing was performed through exposure to UV on a transilluminator table for 40 min. Stamps were removed and the microstructured stencils were peeled off the sellotape. Next, the stencil was placed on a PDMS-coated coverslip. A drop of 50 µg/ml FN in PBS or 45 µg/ml Collagen I in acetic acid mixed with 0.3% of an antibody was placed in top for 60 min. Trapped air bubbles were removed by degassing the construct for 2min. Afterwards, the solution was discarded and the membrane peeled off carefully from the elastomer substrate. Non-printed areas were blocked with 1% Pluronic® F-127 in ddH2O for 10 min at 37°C in order to prevent cell adhesion. Finally, the substrate was carefully rinsed tree times with ddH2O.

2.2.2.3 CYTOOchips
A Starter’s CYTOOchip bears four different fluorescently labeled FN micropatterns (disc, crossbow, H and Y) in three sizes (1600 µm², 1100 µm², 700 µm²). The CYTOOchips were placed in independent wells of a 6 well plate. It was made sure that the CYTOOchips were placed correctly so that the CYTOO logo could be read the right way in the lower right of the chips. Since CYTOOchips were already patterned and coated by the manufacturer cells were ready to be dispensed into each well containing a CYTOOchip.

2.2.3 Cell culture
2.2.3.1 Cultivation and passaging adherent cells
Human vulva carcinoma-derived A431 subclone AK13-1 cells, producing human keratin 13-EGFP, and immortalized human keratinocyte-derived subclone HaCaT B10 cells, producing human keratin 5-EYFP cells, were grown in DMEM supplemented with 10% FCS Gold at 37°C and 5% CO2. In addition, 500 µg/ml G418 was added to the culture medium of HaCaT B10 cells. For subculturing purposes, cells were passaged after reaching 70-90% confluence, taking approximately up to 2 to 3 d. Medium was aspirated and cells were washed shortly with DPBS. Cells were trypsinized by adding a trypsin/EDTA solution and incubating them for about 15 min at 37°C and 5% CO2. Fresh medium was added and trypsinized cells were pipetted up and down several times to ensure a uniform cell suspension. To ensure a uniform, single-cell suspensions cell strainers with a pore size of about 40 µm were used. Cells were pelleted by 1000 rpm for 3 min, the supernatant was aspirated and cells were resuspended in fresh media, and transferred into a fresh flask containing fresh medium, ensuring an appropriate dilution concentration.

2.2.3.3 Cryopreservation of mammalian cells
For freezing procedures, medium was aspirated and confluent grown cells washed shortly with DPBS and trypsinized with trypsin/EDTA at 37°C and 5% CO2 until cells detached. Fresh DMEM medium supplemented with 10% FCS Gold was added and cells were pipetted up and down several times to ensure a uniform cell suspension. Next, cells were pelleted by low speed centrifuging at 1000 rpm for 3 min. Medium was discarded and cells were resuspended in pre-cooled freezing medium and aliquoted into cyrotubes. The cyrotubes were incubated in a vessel containing isopropanol at -80°C overnight and transferred into liquid nitrogen for long-term storage.
For thawing cells, cyrotubes were swayed in a 37°C pre-warmed water bath for rapid thawing. Subsequently, cells were resuspended in pre-warmed fresh DMEM medium supplemented with 10% FCS Gold and seeded into a new flask.

2.2.3.4 Cell seeding on micropatterns
After the fabrication of micropatterned substrates cells were collected by trypsinization as described above. Cells were diluted to a concentration of 15000 cells/ml or less in fresh DMEM medium supplemented with 10% FCS Gold, dispensed onto micropatterned substrates and incubated at 37°C and 5% CO2. Depending on the cell line, after about 2-7 h non-adherent cells were removed by gently aspirating the medium without letting the coverslips dry out entirely. DPBS was added and aspirated off. It was checked under the microscope for floating cells. If a large number of floating cells were observed, washing procedure was repeated. DPBS was replaced with fresh medium. Thereafter, it was checked repeatedly for full cell spreading.

2.2.4 Immunofluorescence staining
After cell seeding and spreading on micropatterns, medium was aspirated and substrates washed briefly in pre-warmed PBS. Cells were fixed for 5 min at -20°C in methanol and subsequently for 20 s at -20°C in acetone. After fixation, substrates were air-dried until acetone evaporated and then rinsed with PBS for 10 min at RT. Immunostaining was performed at RT for 1 h in primary antibody. Next, cells were rinsed tree times with PBS and then incubated for 1 h at RT with the secondary antibody in the dark. After three times washing with with PBS for 10 min cells were rinsed in ddH2O and finally mounted with Mowiol supplemented with 1 µg/ml DAPI on microscope slides.

2.2.5 Image acquisition and analysis
Immunofluorescence staining was assessed by an Axio Imager M.2 microscope equipped with an ApoTome.2 unit using an Axiocam MRm camera and with EC Plan-Neofluar 10x/0.30 Ph 1, Plan-Apochromat 20x/0.8, EC Plan-Neofluar 40x/0.75 and Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC M27 objectives. In general, best automatic settings were chosen for exposure.
Fluorescence recording was also done by confocal laser scanning microscopy using a LSM 710 Duo. When more than one fluorophore was used in a single sample, the emission spectra were adjusted to prevent significant overlap. Except for the comparison of fluorescence intensity, best automatic settings were chosen for laser intensity and gain. The diameter of the pinhole amounted to 1 AU.
The evaluation of pictures was done using the Zeiss ZEN 2009 software and the AxioVision software. Image processing was performed using the ImageJ-based image processing program FIJI. For generating heat maps CYTOO tooL for Image Processing-Reference cell, an ImageJ macro provided by CYTOO Inc., was tested.

[nextpage title=”3.1 Experimental results from lithographical techniques”]

3 Results
3.1 Experimental results from lithographical techniques
In order to regulate cell shape and subsequently the cytoskeleton, adhesive islands consisting of ECM-proteins and of different geometric shapes were generated. For this approach, geometric shapes of different sizes were designed and written on a photomask during a photolithography process and subsequently transferred onto a silicon master (Fig. 6 A). The silicon master was used for casting PDMS stamps, which in turn were used for substrate patterning either by µCP (Fig. 6 B) or by stencil patterning (Fig. 6 B) through the fabrication of stencils.

The microstructures are shown in Figure 7. By way of illustration, the micropatterns are shown as they are observed on stencils. Two types of micropatterns were designed: bowtie (Fig. 7 A) and single (Fig. 7 B) patterns. Each pattern was designed in four different sizes allowing an average cell spreading area of 1600 µm², 1100 µm², 900 µm² and 700 µm². The distance between the patterns amounted to approx. 150 µm in order to prevent cells from bridging the gap between the patterns.

Most patterns were well molded and the holes spanned the entire stencil. However, some patterns (Fig. 7 *), especially those composed of thin lines, showed an insufficient or no through holes, which cause malformed or no micropatterns during stencil patterning.

[nextpage title=”3.2 Comparing µCP and stencil patterning”]

3.2 Comparing µCP and stencil patterning
In the scope of this work, unmodified glass slides were used for µCP. Stamp was incubated with a FN/fluorescently labelled secondary antibody ink solution for 1 h. After aspirating the solution and drying the ink, the microstructured stamp surface was placed in contact with the non-treated glass substrate for 1 min, 30 min and 1 h respectively. The resulting patterns are illustrated in Figure 8. Local inhomogeneity of protein density and malformed patterns was observed frequently. In some cases, a faint imprint indicated a small displacement of the stamp during the process. Other regions were covered completely with the ink solution. Overall, µCP with unmodified glass surfaces show an insufficient protein patterning.

In order to achieve better results, a second printing method was tested. Stencil patterning is based on the usage of thin sheets comprising through holes of the desired pattern and size. The stencil is deposited on a silicone elastomer substrate and a coating solution is placed on top of the microstructured stencil. Areas outside the through holes are protected from coming into contact with the coating solution whereas regions with through holes are exposed to the solution and are locally modify.
Compared with the results of µCP this approach shows better performance in homogeneity of protein density and in fabricating accurate features (Fig. 9).

[nextpage title=”3.3 Behavior of cells on micropatterns”]

3.3 Behavior of cells on micropatterns
Due to the superior performance in protein patterning, stencil patterning was chosen for all subsequent experiments. After protein patterning, a subsequent incubation with the antifouling agent Pluronic® F-127 was performed in order to passivate non-printed regions and to allow specific adhesion of cells to the micropatterns. AK13-1 and HaCaT B10 cells were seeded at a density of 104 cells per cm2 and were maintained at 37°C and 5% CO2. Because cell attachment and full cell spreading time vary between the different cell lines, an adequate incubation time needed to be found accordingly. Generally, cells were checked in 2-4 h steps up to 24 h for cell attachment and spreading.
Both cell types on printed silicone elastomer substrates differed in shape and spreading behavior from cells on other substrates. While most cells attached rapidly on silicone elastomer substrates coated wholly with FN, on FN coated glass coverslips and on non-coated glass coverslips and reached about 50 µm in diameter, cells on micropatterned silicone elastomer substrates needed >6 h for cell attachment.
In order to minimize cell attachment time the passivation step with the antifouling agent Pluronic® F-127 was excluded since only a negligible number of attached cells were observed on non-coated silicone elastomer substrates and because Pluronic® F-127 is suspected to attach to micropatterns and thus prevent proper cell attachment and spreading. Cell micropatterning without the usage of Pluronic® F-127 resulted in a faster cell attachment (The time needed for cells to spread on micropatterns was approx. 24 h and remained unchanged despite the usage of conditioned cell culture media. To find out whether cells favored printed glass substrates over printed silicon elastomer substrates cells were tested for spreading time on CYTOOchips and on printed elastomer silicon substrates. A comparison revealed no notable changes in cell spreading time.

[nextpage title=”3.4 Normalized cell shape”]

3.4 Normalized cell shape
To investigate the role of geometric features on the KIF network and to identify the appropriate size of patterned features, AK13-1 cells and HaCaT B10 cells spread on micropatterns with an average cell spreading area of 700 µm², 900 µm², 1100 µm² and 1600 µm² were analyzed. After cell attachment and spreading an increased number of malformed micropatterns could be observed (Fig. 10). These were mostly micropatterns occupied by one or multiple cells, suggesting that the printed proteins were peeled off by the cells, resulting in pattern degradation. A retreat of the micropattern boundaries is observed, which correlates with the cell boundaries (Fig. 10 A’ and B’). As the overall shape of the patterned cells was unchanged, these cases were also documented and the effects of pattern degradation on the distribution of KIFs assessed as negligible or insignificant.

Fully spread single cells were found often on small micropatterns (Fig. 11 A-A”’) whereas an increase in micropattern size led to an increase in the number of cells per micropattern (Fig. 11 B-B”’) or to incomplete cell spreading of single cells (Fig. 11 C-C”’). Hence, less or no fully spread single cells could be found for many large micropatterns.

[nextpage title=”3.5 Distribution of KIFs in normalized cells”]

3.5 Distribution of KIFs in normalized cells
Since in most cases only a small number of normalized cells existed the distribution of human keratin 5 filaments in HaCaT B10 cells and human keratin 13 filaments in AK13-1 cells was assessed based on individual cell images. Independent of the pattern shape and size both keratin filament networks formed a dense network braiding the nucleus and radiated toward the cell periphery. Compared to the compact perinuclear network a decreasing toward the corners was observed, particularly evident in teardrop-shaped (Fig. 13 A”), triangle-shaped (Fig. 13 C”, 15 B’ and 15 C’), square-shaped (Fig. 14 D’) and arrow-shaped (Fig. 14 C’) cells.

While the average distribution of human keratin 5 in HaCaT B10 cells could quantitatively assessed by generating heat maps of cells spread on crossbow-shaped (Fig. 16 A), disc-shaped (Fig. 16 B) and Y-shaped (Fig. 16C) micropatterns with an average cell spreading area of 700 µm², the average distribution of human keratin 13 in AK13-1 cells was assessed by generating heat maps of cells spread on teardrop-shaped (Fig. 16 E), disc-shaped (Fig. 16 F), arrow-shaped (Fig. 16 G) and square-shaped (Fig. 16 H) micropatterns with an average cell spreading area of 1100 µm².
Images were exported into ImageJ and analyzed with CYTOO tooL for Image Processing-Reference cell, an ImageJ macro provided by CYTOO Inc. Images were aligned, stacked, averaged and pseudo-colored to represent regions of high and low intensity where blue hues represent low frequency of protein localization and red hues represent high frequency of protein localization. If necessary, the macro was adjusted for individual image stacks so that it could identify the corresponding fluorescent micropatterns in order to delineate regions centered on micropatterns and to realign the image stack in all channels.

The observation of the average distribution of human keratin 5 in HaCaT B10 cells and of human keratin 13 in AK13-1 cells as seen in individual cell images (Fig. 13-15) could be confirmed for the corresponding shapes. A high average distribution of the KIFs could be observed around the nuclei together with a decrease of the average distribution of the KIFs toward the cell periphery.

[nextpage title=”4 Discussion”]

4 Discussion
Cell micropatterning is becoming a powerful tool for controlling the cellular microenvironment and shape and for studying the effects of physical cues on cellular behavior. Cell micropatterning offers many advantages over growing cells in flasks or in culture dishes according to standard cell culture methods. Micropatterning cells, so as to force them to fit in a certain geometric pattern and size, enables to analyze cellular behavior and to facilitate reliable and reproducible statistical analyses in small scales (~10-50 cells). The objective of this work was to establish a cell micropatterning method for patterning adhesion proteins like FN in predefined geometries on substrates and to analyze the cytoskeleton of single cells grown on these micropatterns.

4.1 Stencil patterning as the protein patterning method of choice
Two methods were testes for patterning FN on substrates: µCP on glass substrates and stencil patterning on silicone elastomer substrates. Stencil patterning showed a significantly better performance than µCP in fabricating accurately shaped micropatterns with a uniform and homogeneous distribution of FN, which constituted the basis for subsequent experiments in the scope of this work and for future experiments.

4.2 Small micropatterns are suitable for single cell analyses
In the next step, the behavior of cells on micropatterned silicone elastomer substrates was analyzed. On average more single cells were found on micropatterns with an average cell spreading area of 700 µm² than on larger micropatterns. This is due to the fact that an attached cell tends to migrate within a large micropattern without fully adapting to its shape and size (Huang et al., 2005; Théry, et al., 2006; Tseng et al., 2012). In the worst case, with time the cell divides, resulting in multiple cells per micropattern. For quantitative analyses of the cytoskeleton of single cells micropatterns with an average cell spreading area of 700 µm² are to be preferred for the cell lines used within this work.

4.3 KIFs show a perinuclear distribution in normalized cells
For quantitatively assessing the distribution of KIFs, heat maps were generated in a number of cases. Since in most cases only a small number of cells of exactly the same size and shape existed the distribution was assessed based of individual cell images. Analyses of the KIF network showed a perinuclear distribution and a decrease toward the corners, irrespective of cell shape and size. Heat maps of selected cell shapes confirmed the observation that the KIF localization was highest around the nucleus and lowest at the edges. These findings indicate that KIFs do not respond to geometrical cues. Similar results were shown for vimentin intermediate filaments (Shabbir et al., 2014). The VIF network of NIH/3T3 cells patterned on differently shaped micropatterns (700 µm²) showed a mostly perinuclear distribution, a decrease toward the cell periphery and an absence in regions marked by sharp edges.
However, a large-scale analysis with more normalized single cells is essential to confirm these first results and to produce a robust statistic, which will provide a more comprehensive view of the biological role of geometrical cues on the behavior of KIFs.
Irrespective of the meaning of geometrical influences on the KIF network, normalized cells enable to build density maps of protein distribution and hence to construct a reference cell, which can serve as a template for identifying cytoskeletal alternations in mutant cells to decipher the role of different molecular components in regulating the cytoskeleton. Future analyses with micropatterned substrates should explore the interplay of KIFs with microfilaments and microtubules in single, dual and triple filament depleted cells.
Even smallest changes in the keratin motion and turnover in response to regulatory cues can now be quantitatively assessed in great detail with less effort than before (Moch et al., 2013).
Furthermore, the use of micropatterns can be an efficient setup to analyze the role of cell-ECM interactions. Take, for example, Y-shaped micropatterns that show ECM-rich regions and regions devoid of ECM, which providing stringent and stationary boundary conditions to cells. Previous studies showed that keratin filament nucleation starts in the cell periphery in close vicinity to focal adhesions (Windoffer et al., 2006), which provide structural links between the ECM and the cytoskeleton. Therefore, it would be interesting to analyze the distribution of focal adhesions in cells spread on Y-shaped micropatterns in order to find out whether the distribution of focal adhesions is restricted to the cell periphery that co-localizes with the edges of the Y-shaped micropattern or if it focal adhesions are also localized in peripheral regions that are in no contact with the ECM of the Y-shaped micropattern. Since focal adhesions connect the ECM to the cytoskeleton, localization is only to be expected in the cell periphery that co-localizes with the ECM-rich regions of the Y-shaped micropattern. Thus, the interplay between focal adhesions, keratin filament nucleation sites and the keratin cycle dynamics can be explored.

4.4 Challenging tasks for future analyses
For analyzing single keratin filaments and keratin bundles, a high resolution and an appropriate spreading of the KIF network have to be achieved. For this purpose, cells have to reach a minimum size in diameter that would allow an appropriate spreading of the cytoskeleton and hence an improved discrimination of single filaments within the meshwork. This means that cells have to be cultured on large micropatterns. This will be a challenging task as the current work demonstrated that an increase in micropattern size led to an increase in the number of cells per micropattern or to incomplete cell spreading of single cells. Epithelial cells tend to clump together since adhesion between cells through cadherins is favored over adhesion to fibronectin through integrins, resulting in multiple cells occupying a single micropattern. In order to enable a high yield of single cells attached and fully spread on large micropatterns, new approaches have to be explored and implemented. The focus is to overcome a few major obstacles. First, special attention has to be given to isolating single cells during the first steps of dispersing the initial cell suspension. Secondly, single cells tend to migrate within large micropatterns without reaching a steady-state position. Furthermore, most single cells on large micropatterns do not spread completely in an appropriate time before cell division. A possible solution to these problems is to design and to test new patterns, which would guarantee the attachment of a single cell and a stable positioning of cells to prevent cell migration. Many previous studies already encountered this problem (Théry et al., 2006; Huang et al., 2005; Tseng et al., 2012). E.g. Tseng et al. (2012) explored the influence of different micropattern configurations on the degree of stability of intercellular junction positioning of cell doublets. Among other findings, the study demonstrated that migration of cell doublets on particular micropattern configurations was impaired. Interestingly, micropattern configurations, which consist of different combinations of adhesive and non-adhesive areas, seem to be promising for controlling cell positioning. Additionally, these micropatterns offer less area for cell attachment thus minimizing the probability of the attachment of multiple cells. Designing micropatterns with different configurations of Y-shaped and X-shaped micropatterns ought to be seriously considered if cells with a substantial diameter are needed.
Although bowtie shaped patterns were designed for the analyses of cell doublets they were not tested as it lay beyond the scope of the present work. Nonetheless, several cell doublets were observed and a few cell doublets were documented on H-shaped micropatterns of the CYTOOchips (Fig. 17). It was observed that H-shaped micropatterns provided a highly stable configurations in which each cell was positioned on each side of the gap.

In conclusion, as a result of this work a setup for cell micropatterning has been successfully established. It was determined that the cell lines used in the scope of this work reached a steady-state position on micropatterns with a small cell spreading area and a micropattern configuration consisting of different combinations of adhesive and non-adhesive areas. First results indicate that the KIF network does not respond to local geometrical cues since the distribution of the keratin filaments looks strikingly similar on different micropatterns. A more extensive analysis of the keratin filament distribution is necessary for a robust statistic and for building a reference cell. The results of this work paves the way for analyzing the interplay of the KIF network with other cellular components under controlled microenvironmental parameters.

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5 Literature
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Was versteht man unter Cell micropatterning?

Cell micropatterning steht für eine Vielzahl von verschiedenen Methoden, welche die genaue Kontrolle über die Zellform und Zellpositionierung auf einem Substrat gemeinsam haben. Zum Beispiel ist es möglich, einzelne Zellen in Form eines Kreises, Vierecks, Dreiecks oder gar eins Sterns oder Mondes zu kultivieren.

Um zu verstehen, wie Zellen eine solche Form annehmen können, muss man wissen, dass Zellen in ihrer natürlichen Umgebung, d.h. in vivo von einem komplexen Netzwerk von sezernierten Proteinen und Kohlenhydraten umgeben sind, bestehend z.B. aus Fibronektin, Collagen oder Laminin, zusammengefasst unter dem Begriff extrazelluläre Matrix (EZM). Die extrazelluläre Matrix dient einfach ausgedrückt als Fixierungsmöglichkeit für Zellen. Ferner reguliert die EZM-Zell-Interaktion das Verhalten der Zelle während des Zellwachstums, der Proliferation, der Differenzierung oder der Zellmigration.

Wenn nun die extrazelluläre Matrix als eine Fixierungsmöglichkeit, also als ein Adhäsionsvermittler (banal formuliert als eine Art „Kleber“) dient, bedeutet das, dass sich Zellen auf diesen adhäsiven Regionen ansiedeln können.

Die verschiedenen Methoden zum Cell micropatterning machen sich dieses Konzept zu Nutze, indem sie Substrate für die Zellkultivierung herstellen, auf denen adhäsive und nicht-adhäsive Regionen vorzufinden sind, sodass Zellen nur auf adhäsiven Regionen ansiedeln können. Diese adhäsiven Regionen können zudem in einer bestimmten Geometrie generiert werden und werden als Mikrostrukuren (micropatterns) bezeichnet. Wachsen Zellen auf solchen Mikrostrukturen, können sie je nach Form und Größe der Mikrostrukturen eine annähernd ähnliche Form annehmen.

Ein Beispiel zur Herstellung von mikrostrukturierten Substraten:

Eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Herstellung mikrostrukturierter Substrate ist das Mikrokontakt-Drucken (micro-contact printing). Dafür ist ein Stempel von Nöten, der i.d.R. aus einem Polymer wie Silikon hergestellt wird. Dafür wird das Polymer zunächst in flüssiger Form über ein strukturiertes Masterrelief gegossen und ausgehärtet. Während des Aushärtungsprozesses bildet die Topographie der Gussform die strukturierte Oberfläche des zukünftigen Stempels ab. Der fertige Stempel kann dann mit Molekülen wie Fibronektin benetzt werden, ähnlich dem Prinzip einer Tinte bei einem Stempel. Und ähnlich dem Prinzip des Hochdruckverfahrens wird der Stempel mit einem Substrat in Kontakt gebracht und das Fibronektin auf die Substratoberfläche übertragen.

Anwendungen in der Zellbiologie

Das Anwendungsgebiet der Methode ist vielschichtig. Zu den ersten Untersuchungen, welche mikrostrukturierte Substrate in der Zellbiologie benutzten, gehörte die 1997 veröffentlichte Studie „Geometric Control of Cell Life and Death“ von Chen et al. Darin zeigten die Autoren, dass mit der Zunahme der Mikrostrukturengröße die Rate an gestorbenen Zellen abnimmt und gleichzeitig eine Zunahme der DNA Synthese erfolgt. Damit konnten sie nachweisen, dass die Größe der Zellausbreitungsfläche zur Zellteilung und zum Zelltod beiträgt.

Auch die exakte Geometrie der Mikrostrukturen hat einen Einfluss auf das Zellverhalten, insbesondere auf das Zytoskelett. Das Zytoskelett ist ein dynamisches, netzwerkartiges Geflecht aus miteinander verbundenen Proteinen innerhalb der Zelle. Dabei wird zwischen drei verschiedenen Klassen des Zytoskeletts unterschieden.

Ähnlich einem Knochenskelett verleiht das Zytoskelett der Zelle seine Form und ist u.a. für die Stabilität und die Fortbewegung der Zelle notwendig. Aber im Vergleich zu einen Knochenskelett ist das Zytoskelett einer Zelle weitaus flexibler. Zum Beispiel muss für die Fortbewegung der Zelle das Netzwerk immer wieder umgestaltet werden. Das wird dadurch erreicht, dass je nach Bedarf Bereiche des Netzwerkes abgebaut und anderswo wieder aufgebaut werden. Je nach Bedingungen der Umgebung der Zelle kann das Zytoskelett eine entspannte oder starre Form annehmen. Dieser Zustand kann unter Umständen Einfluss auf die Differenzierung bzw. auf das Zellschicksal haben. Mit Mikrostrukturen kann auch die Kontraktilität des Zytoskeletts beeinflußt werden.

In der Studie von Kilian et al. (2010) wurden humane mesenchymale Stammzellen auf pentagonförmigen und sternförmigen Mikrostrukturen kultiviert. Dabei wiesen die humanen mesenchymalen Stammzellen auf stermförmigen Mikrostrukturen eine erhöhte Actomyosin-Kontraktilität auf und differenzierten eher zu Osteoblasten (knochenbildende Zellen). Unter den gleichen Bedingungen, aber auf pentagonförmigen Mikrostrukturen wiesen die humanen mesenchymalen Stammzellen eine niedrigere Actomyosin-Kontraktilität auf und differenzierten eher zu Adipozyten (Fett-speichernde Zellen).

Es ist erstaunlich zu sehen, zu welch unterschiedlichen Zellschicksalen bereits ein so minimaler Unterschied der Form der Mikrostrukturen führen kann. Der einzige Unterschied zwischen den Strukturen liegt darin, dass die eine Struktur eine konkave Wölbung und die andere eine konvexe Wölbung aufweist.

Neben Untersuchungen der Einflüsse der Geometrie von Mikrostrukturen existieren auch rein praktische Gründe, mikrostrukturierte Substrate zu benutzen. Hat man erstmal ein Substrat, auf dem alle kultivierten Zellen gleich aussehen, ergeben sich gleich mehrere Vorteile.

Zunächst einmal ergibt sich aus den gleich aussehenden, gleichverhaltenden Zellen der Vorteil, dass alle Zellen viel leichter zu vergleichen sind als Zellen ohne eine einheitliche Form. Außerdem ergibt sich daraus natürlich auch eine hohe Rate an Reproduzierbarkeit und Verlässlichkeit der Ergebnisse. Möchte man z.B. wissen, wo innerhalb der Zelle sich ein bestimmtes Protein befindet (ob an der Zellgrenze, im Zellkern oder in der Nähe anderer Zellorganellen), könnte eine Untersuchung an Zellen, kultiviert nach klassischen Zellkulturbedingungen, langwierig und schwierig sein. Nach klassischen Zellkulturbedingungen kultivierte Zellen weisen meist keine einheitliche Morphologie auf, sodass die Lokalisation eines bestimmten Proteins und der Vergleich zwischen den Zellen schwer fallen würde und mit großem Aufwand verbunden sein könnte. Weisen die Zellen hingegen alle eine gleiche Morphologie auf, kann eine Aussage über die Lokalisation eines bestimmten Proteins bereits subjektiv schnell vorgenommen werden. Hat man Aufnahmen mehrerer Zellen, auf denen ein bestimmtes Protein markiert ist, kann eine Heatmap erstellt werden, welche die durchschnittliche Verteilung des Proteins aufzeigt.

Verfährt man ähnlich bei der Untersuchung weiterer Proteine, kann anschließend eine sogenannte Zellkarte erstellt werden, die die Lokalisation verschiedener zellulärer Bestandteile in einer Graphik zusammenfasst.

Matthieu Piel, Manuel Théry und seine Kollegen haben dazu eine beeindruckende Sammlung solcher Heatmaps und Zellkarten erstellt, ein Blick in ihren Arbeiten* lohnt sich!

Ein nicht zu vernachlässigender Vorteil ist zudem die Möglichkeit Aufnahmen am Mikroskop zu automatisieren. Da der Abstand der Mikrostrukturen einem definierten Wert entspricht, kann das Mikroskop so programmiert werden, dass es automatisch zu der nächsten Mikrostruktur fährt und die entsprechende Zelle dokumentiert.

Es gibt viele weitere Anwendungsmöglichkeiten, die ich hier leider nicht alle auflisten kann. Zusammen mit Knox habe ich hier ebenfalls einen Artikel zum Thema Cell micropatterning erstellt. Schaut doch mal rein! Immer mehr biologische Labore führen diese Methode für ihre Versuche ein. Falls Ihr noch nicht überzeugt seid, seht selbst, wie Cell micropatterning bereits die Welt erobert hat :D

https://twitter.com/Alexis_Verger/status/606442844090466304

Want to make any kind of cell micropatterns with nothing more than your video-projector? check http://t.co/RO8rWRbw9Z pic.twitter.com/9C4qtzniT9

— THERY Manuel (@ManuelTHERY) March 31, 2014

Hier nur eine kleine Auswahl an Publikationen

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Beitragsbild: Retinae Pigmentepithelzellen (RPE1) kultiviert auf Anker-förmige Mikrostrukturen. Gefärbt ist das Aktin-Zytoskelett (grün) und das Protein Transferrin (rot). Aus Grossier et al. (2014) veröffentlicht in The EMBO Journal; approved permission request by John Wiley and Sons.